25
Xromosomal DNK da mavjud genlarni to‘la klonlash uchun DNK o‘lchamiga va olingan
klonlarni soniga e’tibor berish kerak.
Genlarni klonlashda ko‘pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda
maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A)
nukleotidlar ketma-
ketligini saqlovchi iRNK, tRNK va pRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo
(dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya qilinadi.
Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA-dT qo‘sh zanjirli segment hosil bo‘ladi.
Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini
amalga oshiruvchi revertaza
fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o‘taydi.
Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK
sintezida matritsa vazifasini o‘tagan iRNK molekulasi NaOH bilan parchalanadi,
natijada qisqa
ikki zanjirli va to‘liq iRNK molekulasiga komplementar bo‘lgan bir zanjirli kDNK molekulasi
hosil bo‘ladi.
Hosil bo‘lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer
vazifasini o‘taydi. DNK-polimeraza I fermenti yordamida kDNK ning
ikkinchi zanjiri sintez
qilinadi. Hosil bo‘lgan kDNK ning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi
va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. SHu yo‘sinda hosil bo‘lgan kDNK molekulasi
vektor molekulalariga ulangan holda klonlanadi.
Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual
genlarni ajratib olish
quyidagicha amalga oshiriladi - rekombinant plazmida denaturatsiya qilinadi (100
0
S haroratda 5
min., 0,2 N NaOH eritmasida 15 min.), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo‘zg‘almaydigan
holatda turishi uchun nitrotsellyuloza filtriga biriktiriladi. Olingan filtr [g
-32
P] ATF nukleotidi bilan
nishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizatsiya qilinadi.
Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK molekulasiga
komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.
Hosil bo‘lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib, nishonlangan iRNK molekulasi
ajratib olinadi (elyusiya yordamida). Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz
oqsil sintez qilish
tizimida tekshirib ko‘riladi. Hosil bo‘lgan oqsil molekulasini identifikatsiya qilish yo‘li bilan
individual genlarni ajratib olish amalga oshiriladi.
5
